Plasmide CRISPR d'Activation (h) NOSIP: sc-404767-ACT

La NOSIP humaine (nitric oxide synthase interacting protein) est un adaptateur régulateur qui se lie aux synthases de l’oxyde nitrique, notamment eNOS et nNOS, et module la production d’oxyde nitrique ainsi que la signalisation en aval dépendante du cGMP. En influençant le trafic des NOS, la formation de complexes et leur activité, NOSIP peut façonner des processus cellulaires tels que la régulation du tonus vasculaire, la signalisation neuronale et les réponses immunitaires liées à l’oxyde nitrique. Des interactions NOS–NOSIP dysrégulées ont été associées à des modifications de l’équilibre rédox et de la signalisation inflammatoire, faisant de NOSIP une cible utile pour explorer des voies impliquées dans des phénotypes cardiovasculaires et neuro-inflammatoires. L’étude de l’expression et de la fonction de NOSIP aide à préciser comment la biodisponibilité de l’oxyde nitrique s’intègre aux réseaux de signalisation de réponse au stress et à ceux liés aux cytokines dans les cellules humaines.

NOSIP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NOSIP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NOSIP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NOSIP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NOSIP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NOSIP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NOSIP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NOSIP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NOSIP dans les cellules tumorales présentant une expression de NOSIP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.