Nogo CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400819-ACT

RTN4 kodiert Nogo (auch als Reticulon-4 bekannt), ein Protein des endoplasmatischen Retikulums und ein myelinassoziiertes Protein, das das Neuritenauswachsen, die Axonregeneration und die synaptische Plastizität moduliert. Nogo-Isoformen signalisieren über Rezeptoren wie NgR1 und Korezeptoren und beeinflussen dadurch ein RhoA/ROCK-abhängiges Zytoskelett-Remodeling, das Kollabieren des Wachstumskegels sowie Neuron-Glia-Interaktionen. Im ZNS trägt Nogo zur aktivitätsabhängigen Feinabstimmung neuronaler Schaltkreise bei und begrenzt nach Verletzungen strukturelles Remodeling, wodurch die Regulation von RTN4 mit Signalwegen verknüpft ist, die die neuronale Konnektivität steuern. Veränderte Nogo-Signalgebung und -Expression wurden unter anderem im Zusammenhang mit Neurotraumata, Neurodegeneration und neuropsychiatrischen Phänotypen untersucht, bei denen axonales Sprießen und Netzwerkstabilität gestört sind.

Nogo Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RTN4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nogo Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RTN4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RTN4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nogo-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RTN4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nogo-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nogo-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RTN4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.