Nkx-2.2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401844-ACT

NKX2-2 kodiert den Homeobox-Transkriptionsfaktor Nkx-2.2, einen nukleären Regulator, der während der Entwicklung dazu beiträgt, Zellschicksale festzulegen und linienspezifische Transkriptionsprogramme aufrechtzuerhalten. Am besten charakterisiert ist er im zentralen Nervensystem und in den endokrinen Kompartimenten des Pankreas, wo er Differenzierung und Reifung koordiniert, indem er in Homeodomänen-Netzwerke eingebunden ist und die epigenetische Kontrolle der Genexpression mitsteuert. Die Aktivität von NKX2-2 beeinflusst Entwicklungs-Patterning-Prozesse und nachgeschaltete genregulatorische Schaltkreise, die die Festlegung von Vorläuferzellen, Proliferation und terminale Differenzierung prägen. Eine fehlregulierte NKX2-2-Expression wurde in verschiedenen Krankheitskontexten beschrieben, die mit veränderten Differenzierungszuständen und aberranten Transkriptionsprogrammen einhergehen, was NKX2-2 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung entwicklungsbiologischer und onkogener Transkriptionsnetzwerke macht.

Nkx-2.2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NKX2-2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Nkx-2.2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NKX2-2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NKX2-2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Nkx-2.2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NKX2-2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Nkx-2.2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Nkx-2.2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NKX2-2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.