Particules Lentivirales d'Activation (m) NKCC1: sc-422971-LAC

Slc12a2 code le cotransporteur Na⁺-K⁺-2Cl⁻ NKCC1, un transporteur électroneutre largement exprimé qui couple les gradients de sodium et de potassium à l’entrée de chlorure, régulant ainsi l’homéostasie intracellulaire du Cl⁻, le volume cellulaire et la sécrétion épithéliale de liquide. Dans les tissus de souris, NKCC1 contribue aux mouvements d’ions et d’eau à travers les épithéliums, influence l’excitabilité neuronale via une signalisation GABAergique dépendante du chlorure et soutient les réponses sécrétoires ainsi que l’adaptation au stress osmotique. L’activité de NKCC1 s’intègre à la signalisation des kinases WNK–SPAK/OSR1 et interagit fonctionnellement avec les cotransporteurs KCC pour fixer les niveaux de chlorure cellulaires. Des processus de transport liés à NKCC1 et dérégulés ont été associés à des œdèmes et à des dysfonctionnements de barrière, à des altérations de l’activité des réseaux neuronaux et à des physiopathologies impliquant une perturbation de l’équilibre hydrosodé, faisant de Slc12a2 une cible pertinente pour des études mécanistiques en biologie du transport.

Les particules d'activation lentivirales NKCC1 (m) répondent à ce besoin en encapsulant le système complet d'activation transcriptionnelle SAM (Synergistic Activation Mediator) dans des particules lentivirales à titre élevé prêtes à la transduction, permettant une régulation à la hausse efficace de Slc12a2 dans un plus large éventail de types de cellules humaines.

Les particules d'activation lentivirales NKCC1 (m) délivrent tous les composants fonctionnels du système médiateur d'activation synergique (SAM) via la transduction lentivirale. Le système comprend trois préparations de particules co-transduites dans les cellules cibles : l'une codant pour une dCas9 catalytiquement inactive (mutations D10A et N863A) fusionnée au domaine de transactivation VP64 avec un gène de résistance à la blasticidine ; une codant pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1 avec un gène de résistance à l'hygromycine ; et une codant pour un ARNsg de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 avec un gène de résistance à la puromycine. Après transduction lentivirale et intégration génomique des cassettes d'expression, les composants du SAM sont exprimés de manière stable et s'assemblent au locus cible dans la région promotrice proximale en amont du site de départ de la transcription Slc12a2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de manière coopérative pour recruter l'appareil transcriptionnel endogène et induire une régulation à la hausse soutenue de l'expression endogène de NKCC1. L'utilisation de dCas9 inactif sur les nucléases évite l'introduction de cassures double brin de l'ADN et préserve le locus génomique natif Slc12a2 ainsi que l'architecture régulatrice.

Le format lentiviral offre plusieurs avantages pratiques : l'intégration génomique stable permet une activation héréditaire au fil des divisions cellulaires ; les préparations de particules à titre élevé éliminent le besoin d'une production virale en interne ; et la compatibilité avec les types de cellules primaires, non divisibles et résistantes à la transfection élargit l'accessibilité expérimentale. Le succès de la transduction peut être confirmé et renforcé par une triple sélection antibiotique utilisant la puromycine, l'hygromycine et la blasticidine.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.