neurexin I CRISPR Activation Plasmid (r): sc-437279-ACT

Neurexin I ist ein präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül, das die Bildung und Reifung von Synapsen organisiert, indem es über den synaptischen Spalt hinweg an Neuroligine und andere synaptische Partner bindet. In Rattenneuronen unterstützt es die Wahrscheinlichkeit der Neurotransmitterfreisetzung, das Andocken synaptischer Vesikel sowie die aktivitätsabhängige Umgestaltung neuronaler Schaltkreise und verknüpft damit extrazelluläre Erkennung mit intrazellulärem Gerüstaufbau (Scaffolding) und Signalübertragung. Neurexin-vermittelte Komplexe stehen in Wechselwirkung mit der Positionierung von Calciumkanälen und der Architektur der synaptischen aktiven Zone und beeinflussen so das Gleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Transmission sowie die Netzwerk-Konnektivität. Eine Fehlregulation von Neurexin-Signalwegen wird mit Mechanismen neuroentwicklungsbedingter und neuropsychiatrischer Erkrankungen in Verbindung gebracht, was Neurexin zu einem wichtigen Ziel für die Untersuchung von Synaptopathien und schaltkreisbezogenen Phänotypen in Modellsystemen macht.

neurexin I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen -Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

neurexin I Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des -Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der -Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen neurexin I-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native -Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von neurexin I-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des neurexin I-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem -Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.