Plasmide CRISPR d'Activation (h) NET-4: sc-404621-ACT

Le gène humain **TSPAN5** code **NET-4**, une protéine membranaire de la famille des tétraspanines qui organise des microdomaines enrichis en tétraspanines et module la composition ainsi que la sortie de signalisation des récepteurs partenaires à la surface cellulaire. En servant de plateforme d’assemblage à des complexes d’adhérence et de signalisation, NET-4 influence la communication cellule–cellule, le trafic membranaire et les processus de remodelage du cytosquelette qui façonnent les propriétés des réseaux neuronaux et d’autres comportements cellulaires spécifiques au contexte. Des altérations de la régulation des réseaux de tétraspanines ont été associées à des modifications de la fonction synaptique et à des phénotypes neurodéveloppementaux, faisant de **TSPAN5** un point d’entrée utile pour disséquer la signalisation dépendante des microdomaines membranaires. La régulation de NET-4 est donc pertinente pour l’étude des interactions entre voies de signalisation, de la dynamique des récepteurs et des relations génotype–phénotype dans des modèles cellulaires humains.

NET-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TSPAN5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NET-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TSPAN5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TSPAN5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NET-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TSPAN5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NET-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NET-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de TSPAN5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.