Plásmido CRISPR de Activación (h) NECAP 2: sc-409444-ACT

NECAP2 codifica NECAP 2, una proteína adaptadora endocítica enriquecida en el tráfico mediado por clatrina, que se une a AP-2 y a factores accesorios para coordinar la maduración de las fosas recubiertas y el desrevestimiento de las vesículas. A través de sus interacciones con módulos relacionados con FCHo/Eps15 y con circuitos reguladores de AP-2, NECAP 2 influye en la selección de carga, la internalización de receptores y la dinámica de reciclaje que da forma a la transducción de señales en la membrana plasmática. Estos procesos se entrecruzan con vías que controlan el recambio de receptores de factores de crecimiento, la remodelación sináptica y de membrana neuronal, y las respuestas al estrés celular vinculadas a desequilibrios del tráfico. La endocitosis alterada y la función de proteínas adaptadoras se investigan con frecuencia en biología del cáncer y neurobiología debido a su impacto en la disponibilidad de receptores, la amplitud de la señalización y la homeostasis de membrana.

NECAP 2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de NECAP2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

NECAP 2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus NECAP2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional NECAP2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de NECAP 2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo NECAP2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de NECAP 2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía NECAP 2 en células tumorales con expresión de NECAP2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.