Plasmide CRISPR d'Activation (h) Nebulette: sc-406565-ACT

NEBL code la nébulette, une protéine de liaison à l’actine spécifique du muscle strié, localisée au disque Z, qui contribue à organiser l’architecture des filaments fins dans les cardiomyocytes. Grâce à ses interactions avec l’actine et des composants d’échafaudage du disque Z, la nébulette soutient l’assemblage du sarcomère, la mécanotransduction et la stabilisation de la fonction contractile. Une perturbation de l’expression de NEBL ou de l’intégrité de la protéine est associée à une désorganisation myofibrillaire et à des modifications de la physiologie du muscle cardiaque, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du remodelage du cytosquelette et des voies liées aux cardiomyopathies. En tant que gène humain, NEBL est fréquemment étudié dans des modèles de développement cardiaque, de réponses au stress et de réseaux de signalisation sarcomérique.

Nebulette Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NEBL sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Nebulette Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NEBL dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NEBL, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Nebulette. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NEBL natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Nebulette au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Nebulette dans les cellules tumorales présentant une expression de NEBL silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.