Plasmide CRISPR d'Activation (h) NDR1: sc-402716-ACT

STK38 code NDR1, une kinase sérine/thréonine de la famille NDR/LATS qui agit comme effecteur central dans la signalisation liée à Hippo afin de coordonner la prolifération cellulaire, l’apoptose et l’homéostasie tissulaire. NDR1 intègre des signaux en amont provenant des kinases MST et de protéines échafaudage pour réguler la duplication du centrosome, la progression mitotique et l’organisation du cytosquelette, reliant ainsi la signalisation par kinases au contrôle du cycle cellulaire et aux programmes de polarité. Elle contribue également aux réponses au stress et à l’immunité innée via la modulation de réseaux transcriptionnels et de kinases, avec des effets en aval sur la survie cellulaire et la signalisation inflammatoire. Une activité de NDR1 ou une connectivité de voie dérégulées ont été associées, dans des systèmes expérimentaux, à des altérations du contrôle de la croissance et à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents pour la biologie des cancers et les mécanismes des maladies neurodégénératives.

NDR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STK38 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

NDR1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STK38 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STK38, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de NDR1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STK38 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de NDR1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie NDR1 dans les cellules tumorales présentant une expression de STK38 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.