Plasmide CRISPR d'Activation (h) myotubularin: sc-403912-ACT

MTM1 code la myotubularine, une phosphatase lipidique qui déphosphoryle le phosphatidylinositol 3-phosphate et le phosphatidylinositol (3,5)-bisphosphate, régulant ainsi la signalisation des phosphoinositides au niveau des endosomes et des compartiments impliqués dans le trafic membranaire. En contrôlant l’endocytose, la dynamique membranaire liée à l’autophagie et l’organisation du cytosquelette, la myotubularine contribue au maintien de l’architecture cellulaire et de l’homéostasie des organites. Dans le muscle squelettique, l’activité de MTM1 est étroitement liée aux voies de remodelage membranaire nécessaires à l’intégrité des fibres musculaires et au soutien du couplage excitation–contraction. Des variants à perte de fonction de MTM1 sont associés à la myopathie myotubulaire liée à l’X, ce qui motive des études mécanistiques sur le renouvellement des phosphoinositides et la biologie des cellules musculaires.

myotubularin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTM1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

myotubularin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTM1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTM1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de myotubularin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTM1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de myotubularin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie myotubularin dans les cellules tumorales présentant une expression de MTM1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.