Plasmide CRISPR d'Activation (m) mtTFA: sc-423355-ACT

Tfam code le facteur de transcription mitochondrial A (mtTFA), une protéine du groupe à forte mobilité (HMG) qui se lie à l’ADN mitochondrial afin de compacter les nucléoïdes et de réguler la transcription et la réplication du génome mitochondrial. mtTFA est un déterminant central du nombre de copies d’ADNmt et de l’expression des gènes mitochondriaux, influençant ainsi la phosphorylation oxydative, la production d’ATP et l’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène. Par ces fonctions, il s’intègre aux programmes de biogenèse mitochondriale et aux voies de communication noyau–mitochondries qui façonnent le métabolisme cellulaire et les réponses au stress. Des altérations de l’activité de TFAM et de la maintenance de l’ADNmt sont fréquemment étudiées dans des modèles de dysfonction neuromusculaire, de neurodégénérescence, de phénotypes cardiométaboliques et d’inflammation induite par la signalisation de stress mitochondrial.

mtTFA Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Tfam sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

mtTFA Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Tfam dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Tfam, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de mtTFA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Tfam natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de mtTFA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie mtTFA dans les cellules tumorales présentant une expression de Tfam silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.