Plasmide CRISPR d'Activation (h) MSH2: sc-400966-ACT

MSH2 code un composant central de la machinerie de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR), qui préserve l’intégrité du génome en reconnaissant les mésappariements base–base ainsi que les boucles d’insertion–délétion générées lors de la réplication et de la recombinaison de l’ADN. Chez l’humain, MSH2 forme des hétérodimères avec MSH6 (MutSα) ou MSH3 (MutSβ) afin d’initier la reconnaissance des lésions et de coordonner la réparation en aval avec MLH1/PMS2, reliant ainsi la MMR à la fidélité de la réplication, à la signalisation des dommages à l’ADN et aux réponses des points de contrôle du cycle cellulaire. La perturbation ou la dérégulation de MSH2 compromet la capacité de réparation, augmente la charge mutationnelle et contribue à l’instabilité des microsatellites, un phénotype caractéristique dans de nombreux contextes tumoraux. Par conséquent, MSH2 est largement étudié dans les voies qui régissent la maintenance du génome, la mutagenèse et les réponses cellulaires au stress génotoxique.

MSH2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MSH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MSH2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MSH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MSH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MSH2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MSH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MSH2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MSH2 dans les cellules tumorales présentant une expression de MSH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.