Plásmido CRISPR de Activación (h) MLKL: sc-401248-ACT

La MLKL humana (proteína similar al dominio de quinasas de linaje mixto) es un ejecutor central de la necroptosis, actuando aguas abajo de la señalización RIPK1/RIPK3 para impulsar una muerte celular inflamatoria y lítica. Tras la fosforilación por RIPK3, MLKL sufre una activación conformacional, oligomeriza y se transloca a las membranas celulares, donde altera la integridad de la membrana y favorece la liberación de patrones moleculares asociados al daño. Esta vía se entrecruza con las respuestas inmunitarias innatas, la señalización por citocinas y el diálogo de la muerte celular regulada con la apoptosis y la piroptosis, modulando la inflamación tisular y la defensa del huésped. La actividad desregulada de MLKL y la señalización necroptótica se han implicado en modelos de procesos inflamatorios y neurodegenerativos, lesión isquémica y biología del microambiente tumoral, lo que convierte a MLKL en un nodo útil para estudios mecanísticos.

MLKL El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de MLKL sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MLKL El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus MLKL en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional MLKL, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MLKL. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo MLKL y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MLKL en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MLKL en células tumorales con expresión de MLKL silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.