MISP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409029-ACT

Humanes MISP (mitotic spindle positioning) kodiert ein aktin- und mikrotubuliassoziiertes Protein, das zur Orientierung von Centrosom und Spindel, zum Fortschreiten der Mitose sowie zur Aufrechterhaltung der epithelialen Architektur beiträgt. MISP verknüpft die Umgestaltung des Zytoskeletts mit der Zellzykluskontrolle, indem es die Dynamik des kortikalen Aktins, fokale-Adhäsion-gekoppelte Signalwege und die korrekte Ausbildung einer bipolaren Spindel koordiniert und so eine präzise Chromosomensegregation unterstützt. Eine Fehlregulation der Spindelpositionierung und der zytoskelettalen Organisation wird breit mit chromosomaler Instabilität und veränderter Gewebepolarität in Verbindung gebracht, was MISP zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung von Mechanismen macht, die Adhäsion, Polarität und Zellteilung koppeln. In der biomedizinischen Forschung wird die Modulation der MISP-Expression genutzt, um mitotische Genauigkeit, Kontrolle der Zellform und Signalwegabhängigkeiten in transformierten und nicht transformierten humanen Zellmodellen zu untersuchen.

MISP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MISP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MISP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MISP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MISP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MISP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MISP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MISP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MISP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MISP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.