melanopsin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424378-ACT

Das Mausgen **Opn4** kodiert **Melanopsin**, ein retinales Opsin, das vor allem in intrinsisch photosensitiven retinalen Ganglienzellen exprimiert wird und die nicht-bildgebende Photorezeption vermittelt. Die Melanopsin-Signalübertragung aktiviert G‑Protein‑gekoppelte Phototransduktionskaskaden, die den intrazellulären Calciumspiegel erhöhen und die Membranerregbarkeit modulieren, wodurch die Lichtdetektion mit der zirkadianen Photoentrainierung, dem Pupillenlichtreflex und der Schlaf‑Wach‑Regulation gekoppelt wird. Über retinozerebrale Signalwege unter Einbezug des suprachiasmatischen Nukleus und weiterer hypothalamischer Zielstrukturen beeinflusst **Opn4** neuroendokrine Rhythmen und lichtabhängiges Verhalten. Eine Fehlregulation melanopsinabhängiger Schaltkreise wurde mit gestörter zirkadianer Zeitgebung, veränderten Pupillenreaktionen und Lichtempfindlichkeits-Phänotypen in Zusammenhang gebracht, die für neurobehaviorale und retinale Forschung relevant sind.

melanopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Opn4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

melanopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Opn4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Opn4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen melanopsin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Opn4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von melanopsin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des melanopsin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Opn4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.