Plasmide CRISPR d'Activation (h) MEK Kinase-4: sc-404345-ACT

Le gène humain MAP3K4 code la MEK kinase 4 (également appelée MTK1), une MAP kinase kinase kinase qui agit en amont des cascades MAPK JNK et p38. En tant que nœud de signalisation sensible au stress et aux cytokines, la MEK kinase 4 contribue à relier les signaux environnementaux et développementaux à des programmes transcriptionnels contrôlant l’apoptose, la différenciation et les réponses inflammatoires. L’activité de MAP3K4 participe à la régulation du dialogue croisé médié par les MAPK avec la signalisation des dommages à l’ADN et l’adaptation cellulaire au stress, des processus fréquemment perturbés en cancérologie et lors de dérégulations immunitaires. Une dérégulation de la signalisation MAP3K4–JNK/p38 a été associée à des décisions de destinée cellulaire altérées et à des réponses aberrantes au stress oxydatif et génotoxique, ce qui étaye son intérêt comme modulateur de voie dans des études mécanistiques.

MEK Kinase-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAP3K4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MEK Kinase-4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAP3K4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAP3K4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MEK Kinase-4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAP3K4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MEK Kinase-4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MEK Kinase-4 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAP3K4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.