Med4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406004-ACT

Il gene umano **MED4** codifica **Med4**, una subunità conservata del complesso **Mediator** che collega i fattori di trascrizione specifici di sequenza all’**RNA polimerasi II** per coordinare l’avvio della trascrizione. Med4 contribuisce ai programmi trascrizionali che governano la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e l’espressione genica in risposta allo stress, attraverso un’ampia regolazione della trascrizione dipendente da Pol II. L’alterazione delle subunità di Mediator può modificare l’output trascrizionale globale, con effetti a valle su proliferazione, stabilità del genoma e reti regolatorie specifiche di linea cellulare, frequentemente alterate nel cancro e in altri disturbi che comportano una deregolazione della trascrizione. In quanto nodo nel controllo trascrizionale, **MED4** è utile per studiare come l’architettura di Mediator moduli l’attivazione dei promotori e l’espressione genica dipendente dai segnali.

Med4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MED4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Med4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MED4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MED4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Med4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MED4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Med4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Med4 nelle cellule tumorali con espressione di MED4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.