Plasmide CRISPR d'Activation (h) MDM2: sc-400045-ACT

MDM2 code une ligase E3 de l’ubiquitine qui agit comme principal régulateur négatif de TP53, en favorisant l’ubiquitination de p53, son export nucléaire et sa dégradation par le protéasome afin de limiter les réponses aux dommages de l’ADN. Grâce à une régulation par rétroaction et à son intégration avec la signalisation ATM/ATR, MDM2 influence les points de contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, la sénescence et des programmes transcriptionnels d’adaptation au stress. Une expression ou une activité dérégulée de MDM2 peut modifier la sortie fonctionnelle de la voie p53 et fait l’objet de nombreuses études dans les cancers, où une protéostasie altérée et un contrôle des checkpoints perturbé contribuent à la fitness des cellules tumorales. MDM2 s’interface aussi avec d’autres réseaux, notamment la prolifération médiée par RB/E2F et la signalisation PI3K–AKT, ce qui en fait un nœud utile pour la cartographie des voies et la génomique fonctionnelle.

MDM2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MDM2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MDM2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MDM2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MDM2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MDM2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MDM2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MDM2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MDM2 dans les cellules tumorales présentant une expression de MDM2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.