Plasmide CRISPR d'Activation (h) MCM4: sc-402451-ACT

Le gène humain **MCM4** code une sous-unité centrale du complexe hélicase **MCM2–7**, qui autorise (« licence ») les origines de réplication et assure le déroulement de la double hélice d’ADN durant la phase S. En coordonnant l’activation des origines, la progression des fourches de réplication et les réponses des points de contrôle de la réplication, MCM4 contribue à la stabilité du génome au sein des voies de réplication de l’ADN et de réponse aux dommages de l’ADN. Une perturbation de l’activité de MCM4 peut favoriser le stress réplicatif, l’effondrement des fourches et l’accumulation de lésions de l’ADN, des processus liés à l’instabilité chromosomique observée en cancérologie et dans d’autres troubles prolifératifs. En conséquence, MCM4 est largement utilisé comme nœud mécanistique pour étudier le contrôle du cycle cellulaire, la signalisation du stress réplicatif et les interactions entre voies de réparation de l’ADN.

MCM4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCM4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MCM4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCM4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCM4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MCM4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCM4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MCM4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MCM4 dans les cellules tumorales présentant une expression de MCM4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.