Plasmide CRISPR d'Activation (h) MCAD: sc-402708-ACT

ACADM code la déshydrogénase des acyl-CoA à chaîne moyenne (MCAD) humaine, une flavoprotéine mitochondriale qui catalyse la première étape de déshydrogénation de la β‑oxydation des acyl‑CoA d’acides gras à chaîne moyenne. L’activité de la MCAD contribue à l’homéostasie énergétique cellulaire en permettant un catabolisme efficace des acides gras lors du jeûne et du stress métabolique, reliant l’équilibre rédox mitochondrial à la production d’ATP. Une perturbation ou une diminution de l’expression d’ACADM est associée à une altération de l’oxydation des acides gras à chaîne moyenne et à des profils caractéristiques d’accumulation d’acylcarnitines, largement utilisés en recherche métabolique. Par conséquent, ACADM/MCAD est fréquemment étudié dans les voies impliquées dans la fonction mitochondriale, l’utilisation des lipides et les programmes transcriptionnels répondant aux nutriments.

MCAD Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACADM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MCAD Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACADM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACADM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MCAD. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACADM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MCAD au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MCAD dans les cellules tumorales présentant une expression de ACADM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.