MaxiKα CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402208-ACT

KCNMA1 kodiert die MaxiKα‑(BK-)Kanal‑α‑Untereinheit, einen K+-Kanal mit großer Leitfähigkeit, der durch Ca2+ und Spannung aktiviert wird und intrazelluläre Ca2+-Signale mit der Depolarisation der Membran integriert, um die zelluläre Erregbarkeit zu regulieren. Durch die Formung der Repolarisation des Aktionspotenzials und die Kontrolle der Nachhyperpolarisation beeinflusst MaxiKα die Neurotransmitterfreisetzung, den Tonus glatter Muskulatur, die endokrine Sekretion und die vaskuläre Reaktivität. Der Kanal ist funktionell an Ca2+-Mikrodomänen und Signalwege gekoppelt, die Ionenfluss, Membranpotenzial und Ca2+-Homöostase feinabstimmen, einschließlich Interaktionen mit akzessorischen β-/γ‑Untereinheiten, die die Gating‑Kinetik modulieren. Eine Fehlregulation der KCNMA1‑Aktivität wurde mit Phänotypen erhöhter neuronaler Erregbarkeit, Funktionsstörungen der glatten Gefäß- und Atemwegsmuskulatur sowie veränderten Programmen der Zellproliferation in Verbindung gebracht, was für die Elektrophysiologie- und Ionkanalopathie‑Forschung relevant ist.

MaxiKα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNMA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MaxiKα Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNMA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNMA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MaxiKα-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNMA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MaxiKα-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MaxiKα-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNMA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.