MARCKSL1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403985-ACT

MARCKSL1 (MARCKS-like 1) kodiert ein actinbindendes, membranassoziiertes Protein, das den Umbau des Zytoskeletts, die Zellpolarität und die Motilität über phosphorylierungsabhängige Wechselwirkungen mit Phospholipiden und F‑Actin reguliert. Als nachgeschalteter Effektor der PKC-Signalübertragung ist MARCKSL1 an Signalwegen beteiligt, die Neuritenauswuchs, Lamellipodien-Dynamik und Vesikeltransport koordinieren und so extrazelluläre Signale mit Veränderungen der Zellform verknüpfen. Eine veränderte MARCKSL1-Expression wurde in mehreren Tumorkontexten mit invasiven Phänotypen und metastatischer Progression in Verbindung gebracht, was mit seiner Rolle bei Migration und Adhäsion übereinstimmt. Diese Eigenschaften machen MARCKSL1 zu einem nützlichen Ziel für Untersuchungen zytoskelettgetriebener Mechanismen, die Entwicklung, wundähnliche Reaktionen und die Ausbreitung von Krebszellen zugrunde liegen.

MARCKSL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MARCKSL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MARCKSL1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MARCKSL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MARCKSL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MARCKSL1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MARCKSL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MARCKSL1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MARCKSL1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MARCKSL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.