Plasmide CRISPR d'Activation (m) MAGE-L2: sc-424255-ACT

Magel2 chez la souris code MAGE-L2, un membre de la famille des antigènes de mélanome (MAGE) impliqué dans la régulation neuroendocrinienne hypothalamique et le développement neuronal. MAGE-L2 participe à l’homéostasie des protéines dépendante de l’ubiquitine via des interactions avec des complexes de ligases E3 de l’ubiquitine, influençant le trafic et le renouvellement de protéines cellulaires clés. L’activité de Magel2 a été associée à la régulation du rythme circadien, de l’équilibre énergétique et des voies de signalisation leptine–mélanocortine qui façonnent le comportement alimentaire et le métabolisme. La dérégulation de MAGEL2 est associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et métaboliques, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques des circuits hypothalamiques et de la protéostase.

MAGE-L2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Magel2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MAGE-L2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Magel2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Magel2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MAGE-L2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Magel2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MAGE-L2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MAGE-L2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Magel2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.