LIGHT Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403128-ACT

O TNFSF14 humano codifica o LIGHT, uma proteína de membrana do tipo II da superfamília TNF que atua como um ligante imunomodulador para HVEM (TNFRSF14) e LTβR (LTBR). A sinalização por LIGHT regula a atividade das vias NF-κB e MAPK para moldar a coestimulação de células T, o licenciamento de células dendríticas e programas de citocinas inflamatórias, além de influenciar a organização de tecidos linfoides e respostas vasculares/estromais. A expressão desregulada de TNFSF14 tem sido associada a estados inflamatórios crônicos e patologia mediada pelo sistema imune, sendo frequentemente estudada no contexto de interações tumor–imunidade e remodelação tecidual. Como resultado, o LIGHT é amplamente utilizado como uma ferramenta mecanística para investigar a sinalização na sinapse imune, o tráfego de leucócitos e sinais do microambiente que coordenam a imunidade adaptativa.

LIGHT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TNFSF14 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LIGHT O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TNFSF14 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TNFSF14, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LIGHT. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TNFSF14 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LIGHT no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LIGHT em células tumorais com expressão de TNFSF14 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.