Plasmide CRISPR d'Activation (h) LGA: sc-404294-ACT

Le gène humain **GLS2** code l’isoforme mitochondriale de la glutaminase **LGA**, une enzyme clé qui convertit la glutamine en glutamate et en ammoniac, afin de soutenir les flux de carbone et d’azote vers le cycle de l’ATC (TCA) et les voies biosynthétiques associées. En régulant l’utilisation de la glutamine, **GLS2** influence l’équilibre rédox cellulaire via la synthèse du glutathion et affecte le métabolisme mitochondrial en situation de stress nutritionnel. L’activité de **GLS2** s’inscrit à l’interface des mécanismes de détection des acides aminés et des programmes de réponse au stress, modulant ainsi les états de prolifération et de différenciation dans divers types cellulaires. Une expression dérégulée de **GLS2/LGA** a été associée à des phénotypes métaboliques altérés observés en oncologie et dans des pathologies hépatiques, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude des mécanismes de reprogrammation métabolique.

LGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GLS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GLS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GLS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LGA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GLS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LGA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LGA dans les cellules tumorales présentant une expression de GLS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.