Plasmide CRISPR d'Activation (h) LASS4: sc-406329-ACT

CERS4 (LASS4) code la céramide synthase 4, une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique qui acyle les bases sphingoïdes afin de produire des espèces spécifiques de céramides à longue chaîne. En contrôlant la composition en céramides, LASS4 influence l’organisation membranaire et les processus de signalisation dépendants des sphingolipides, liés à l’apoptose, aux réponses cellulaires au stress et à l’homéostasie métabolique. Des altérations de la synthèse des céramides et du remodelage des sphingolipides ont été associées à une prolifération dérégulée, à l’inflammation et à des phénotypes neuro‑métaboliques, faisant de CERS4 un nœud utile pour étudier la signalisation lipidique et les voies de stress des organites. L’étude fonctionnelle de CERS4 étaye des travaux mécanistiques sur la régulation du devenir cellulaire, de la fonction barrière et de la transduction de signaux médiée par les lipides, sous l’influence des céramides.

LASS4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CERS4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LASS4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CERS4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CERS4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LASS4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CERS4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LASS4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LASS4 dans les cellules tumorales présentant une expression de CERS4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.