Plasmide CRISPR d'Activation (h) LAPTM5: sc-404229-ACT

LAPTM5 (lysosomal protein transmembrane 5) est une protéine membranaire lysosomale/endosomale enrichie dans les cellules hématopoïétiques, qui régule le trafic intracellulaire et l’atténuation des signaux dans les cellules immunitaires. Elle participe au transport vésiculaire et au renouvellement, dépendant des lysosomes, de composants de signalisation, contribuant ainsi à façonner des voies proximales aux récepteurs telles que la signalisation des récepteurs antigéniques, les réponses aux cytokines et la dégradation dépendante de l’ubiquitine. Par ses rôles dans l’organisation endolysosomale et l’homéostasie de la signalisation immunitaire, LAPTM5 est pertinente pour l’étude de l’activation des leucocytes, de la régulation de l’inflammation et des programmes de signalisation dérégulés observés dans divers contextes de maladies hématologiques. Son expression et sa fonction sont également exploitées pour examiner comment le trafic lié aux lysosomes influence les décisions de destinée cellulaire et la protéostasie au sein des lignées immunitaires.

LAPTM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LAPTM5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LAPTM5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LAPTM5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LAPTM5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LAPTM5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LAPTM5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LAPTM5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LAPTM5 dans les cellules tumorales présentant une expression de LAPTM5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.