Plasmide CRISPR d'Activation (h) KRAS: sc-416674-ACT

KRAS code une petite GTPase qui agit comme un interrupteur moléculaire, alternant entre des états liés au GDP et au GTP afin de relayer les signaux provenant des récepteurs tyrosine kinases activés vers des effecteurs en aval. Le KRAS actif coordonne des voies clés, notamment les réseaux RAF–MEK–ERK (MAPK), PI3K–AKT–mTOR et RalGDS, pour réguler la prolifération, la survie, le métabolisme et la dynamique du cytosquelette. Un contrôle strict de la signalisation de KRAS est nécessaire aux décisions normales de destinée cellulaire et à l’homéostasie tissulaire. Une activité de KRAS dérégulée et un remaniement des voies de signalisation sont fréquemment impliqués dans la transformation oncogénique, des réponses au stress altérées et des adaptations de signalisation associées à la résistance dans de multiples contextes tumoraux.

KRAS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KRAS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KRAS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KRAS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KRAS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KRAS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KRAS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KRAS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KRAS dans les cellules tumorales présentant une expression de KRAS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.