Plasmide CRISPR d'Activation (h) KGA: sc-402575-ACT

Le gène humain **GLS** code la glutaminase, dont l’isoforme de type rénal **KGA** catalyse, dans la mitochondrie, la conversion de la glutamine en glutamate et en ammoniac — une étape clé de la glutaminolyse. Cette réaction soutient l’anaplérose du cycle de l’acide tricarboxylique, la gestion de l’azote et la biosynthèse des nucléotides, des acides aminés et du glutathion, reliant l’activité de GLS à l’équilibre redox et aux réponses cellulaires au stress. KGA s’intègre à des programmes de détection des nutriments tels que la signalisation **mTORC1** et interagit avec la régulation métabolique pilotée par **MYC**, modulant la prolifération et la survie lorsque la disponibilité en nutriments varie. Une expression ou une activité dérégulée de **GLS/KGA** a été associée à un remodelage métabolique dans le cancer ainsi qu’à une homéostasie du glutamate altérée dans des contextes neurologiques et inflammatoires, ce qui en fait un nœud central pour des études mécanistiques des phénotypes dépendants du métabolisme.

KGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GLS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KGA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GLS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GLS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KGA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GLS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KGA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KGA dans les cellules tumorales présentant une expression de GLS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.