IPP-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402634-ACT

PPP1R1A codifica o inibidor da proteína fosfatase 1 (IPP-1), um modulador regulado por fosforilação que se liga à PP1 e suprime a sua atividade catalítica, moldando a amplitude e o timing da desfosforilação de serina/treonina. Ao integrar sinais de cAMP/PKA e de outras vias de quinases, o IPP-1 influencia processos dependentes de fosforilação, incluindo a regulação de canais iónicos, a dinâmica do citoesqueleto e o controlo da transcrição. A atividade de PPP1R1A está ligada à sinalização neuronal e à plasticidade sináptica através do controlo de substratos dependentes de PP1, e alterações na inibição de fosfatases têm sido associadas a sinalização desregulada em contextos neuropsiquiátricos e neurodegenerativos. Como nó no equilíbrio entre fosfatases e quinases, PPP1R1A oferece um ponto de intervenção acessível para estudar redes de fosforilação e a reconfiguração de vias a jusante.

IPP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PPP1R1A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IPP-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PPP1R1A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PPP1R1A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IPP-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PPP1R1A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IPP-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IPP-1 em células tumorais com expressão de PPP1R1A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.