Int-6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405759-ACT

EIF3E umano (Int-6) codifica una subunità conservata del complesso del fattore eucariotico di inizio della traduzione 3 (eIF3), supportando l’avvio della traduzione cap-dipendente e coordinando il reclutamento dell’mRNA sulla subunità ribosomiale 40S. Oltre al controllo della traduzione, Int-6 è stato collegato alla proteostasi e alla trasduzione del segnale attraverso interazioni che accoppiano la sintesi proteica alle dinamiche del sistema ubiquitina–proteasoma e a programmi responsivi allo stress. L’attività di EIF3E influenza la progressione del ciclo cellulare, la differenziazione e le risposte adattative allo stress cellulare, rendendolo rilevante per studi sulla riprogrammazione traduttiva. La disregolazione dell’espressione di EIF3E o dell’equilibrio del complesso eIF3 è stata associata ad alterazioni del controllo della crescita e a contesti di segnalazione oncogenica, motivando ricerche meccanicistiche in biologia del cancro e in patologie correlate.

Int-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EIF3E senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Int-6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EIF3E nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EIF3E, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Int-6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EIF3E nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Int-6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Int-6 nelle cellule tumorali con espressione di EIF3E silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.