Plasmide CRISPR d'Activation (h) IDH3G: sc-404994-ACT

IDH3G code la sous-unité gamma de l’isocitrate déshydrogénase 3 dépendante du NAD (IDH3), un complexe enzymatique de la matrice mitochondriale qui catalyse la décarboxylation oxydative de l’isocitrate en α‑cétoglutarate dans le cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs, TCA). En contribuant à la production de NADH, IDH3G soutient la respiration mitochondriale, l’équilibre rédox et le flux métabolique reliant le catabolisme des glucides aux voies biosynthétiques et de signalisation. Une régulation altérée des enzymes du cycle TCA peut modifier la disponibilité en α‑cétoglutarate et la fonction mitochondriale, influençant les réponses au stress et les états de différenciation cellulaire. Le dérèglement du métabolisme mitochondrial et les perturbations du cycle TCA sont des caractéristiques récurrentes en cancérologie et dans d’autres troubles marqués par une altération du métabolisme oxydatif, ce qui fait d’IDH3G une cible pertinente pour des études mécanistiques.

IDH3G Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de IDH3G sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IDH3G Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus IDH3G dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription IDH3G, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IDH3G. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus IDH3G natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IDH3G au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IDH3G dans les cellules tumorales présentant une expression de IDH3G silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.