Plasmide CRISPR d'Activation (h) Id2: sc-400550-ACT

L’ID2 humain (inhibitor of DNA binding 2) code une protéine à motif hélice-boucle-hélice (HLH) dépourvue de domaine de liaison à l’ADN et qui agit en formant des hétérodimères avec des protéines E afin de freiner des programmes transcriptionnels spécifiques de lignée. Id2 régule les décisions de destinée cellulaire, la prolifération et la différenciation dans des contextes immunitaires, neuronaux et épithéliaux, en intégrant des signaux provenant de voies telles que TGF-β/BMP et la signalisation MAPK pour façonner les réponses transcriptionnelles. En modulant des réseaux géniques pilotés par des facteurs bHLH, ID2 influence notamment le maintien des cellules souches/progénitrices et la différenciation terminale, ce qui le rend pertinent pour l’étude de la régulation du développement et de la croissance dérégulée. Des altérations de l’expression et de l’activité d’ID2 ont été associées à des états transcriptionnels oncogéniques et à des perturbations de la différenciation dans plusieurs systèmes modèles pertinents pour les maladies.

Id2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ID2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Id2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ID2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ID2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Id2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ID2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Id2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Id2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ID2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.