HYPE Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406626-ACT

FICD umano codifica HYPE, un enzima a dominio Fic localizzato nel reticolo endoplasmatico che catalizza l’AMPilazione reversibile e la de-AMPilazione di substrati proteici, in particolare della chaperone HSPA5/BiP. Modulando l’attività di BiP, HYPE contribuisce a determinare la proteostasi del RE, la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR) e programmi di stress adattativo che influenzano la capacità di ripiegamento e la secrezione proteica. Questo asse regolatorio collega FICD a vie che controllano l’omeostasi del RE, la gestione del calcio e la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress proteotossico. Una risposta allo stress del RE e una segnalazione UPR deregolate sono implicate nella neurodegenerazione, nelle disfunzioni metaboliche e in fenotipi rilevanti per il cancro, rendendo FICD/HYPE un nodo utile per studi meccanicistici della proteostasi.

HYPE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FICD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HYPE Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FICD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FICD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HYPE. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FICD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HYPE nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HYPE nelle cellule tumorali con espressione di FICD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.