Plasmide CRISPR d'Activation (h) HOOK1: sc-404872-ACT

HOOK1 humain code une protéine adaptatrice se liant aux microtubules, qui relie les moteurs dynéine–dynactine aux cargos endosomaux et organellaires, soutenant le transport dirigé vers l’extrémité « moins » et l’organisation spatiale du trafic membranaire. Par son rôle dans les dynamiques dépendantes des microtubules, HOOK1 contribue à des processus associés au centrosome, à l’assemblage et au maintien des cils, ainsi qu’à la coordination des voies de trafic endosome-vers-Golgi. La perturbation du transport régulé par HOOK1 peut influencer la polarité cellulaire, la progression mitotique et la compartimentation des signaux, ce qui en fait une cible pertinente pour les études de biologie du neurodéveloppement, des mécanismes liés aux ciliopathies et du trafic intracellulaire dérégulé observé dans divers contextes pathologiques. Des altérations de l’expression ou de la fonction de HOOK1 ont également été étudiées en lien avec le comportement des cellules tumorales et les voies de stabilité du génome qui dépendent d’une organisation correcte du cytosquelette.

HOOK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HOOK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HOOK1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HOOK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HOOK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HOOK1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HOOK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HOOK1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HOOK1 dans les cellules tumorales présentant une expression de HOOK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.