HIF PHD3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403671-ACT

EGLN3 codifica a prolil-hidroxilase 3 do HIF (PHD3), uma dioxigenase sensor de oxigénio que hidroxila subunidades HIF-α para promover a ubiquitinação dependente de VHL e a degradação proteassomal em normóxia. Ao ajustar o output transcricional do HIF, a PHD3 influencia a adaptação celular à hipóxia, incluindo o metabolismo glicolítico, a sinalização angiogénica, programas relacionados com a eritropoiese e respostas ao stress oxidativo. A expressão de EGLN3 é regulada de forma dinâmica pela hipóxia e por outros sinais de stress, ligando-a ao controlo por feedback na via do HIF e a redes mais amplas de homeostase redox e mitocondrial. A atividade desregulada de EGLN3/PHD3 e a sinalização do HIF são frequentemente estudadas no contexto da biologia tumoral, do stress tecidular associado à isquemia, da inflamação e de processos neurodegenerativos, nos quais a reprogramação transcricional dependente de oxigénio é um fator determinante do fenótipo.

HIF PHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EGLN3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HIF PHD3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EGLN3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EGLN3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HIF PHD3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EGLN3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HIF PHD3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HIF PHD3 em células tumorais com expressão de EGLN3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.