HEXB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404765-ACT

Das humane HEXB kodiert die Beta-Untereinheit der lysosomalen β-Hexosaminidase, die funktionelle Heterodimere mit HEXA oder Homodimere bildet, um den schrittweisen Abbau von GM2-Gangliosid und anderen Glykokonjugaten zu katalysieren. Diese Enzymaktivität unterstützt den lysosomenabhängigen Umsatz von Makromolekülen sowie weitere Prozesse im Zusammenhang mit endo-lysosomalem Transport, der Wechselwirkung zwischen Autophagie und Lysosomen und dem Lipidkatabolismus. Eine gestörte HEXB-Funktion beeinträchtigt die Sphingolipid-Homöostase und führt zu lysosomaler Speicherbildung, wodurch das Gen mit Varianten der GM2-Gangliosidose und neurodegenerativen zellulären Phänotypen durch Substratanreicherung in Verbindung steht. Als Bestandteil einer lysosomalen Hydrolase wird HEXB häufig im Kontext der Biologie von Neuronen und Gliazellen, des Lipidstoffwechsels und von Stressreaktionen auf eine beeinträchtigte Lysosomenfunktion untersucht.

HEXB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HEXB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HEXB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HEXB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HEXB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HEXB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HEXB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HEXB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HEXB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HEXB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.