Plásmido CRISPR de Activación (h) hepcidin: sc-403222-ACT

El gen humano HAMP codifica la hepcidina, una hormona peptídica producida en el hígado que actúa como regulador central de la homeostasis sistémica del hierro. La hepcidina controla la absorción de hierro de la dieta y el reciclaje de hierro por macrófagos al unirse al exportador de hierro ferroportina (SLC40A1), induciendo su internalización y degradación, lo que reduce el eflujo de hierro hacia el plasma. Su expresión está regulada por señales de detección de hierro y por la señalización inflamatoria, incluida la entrada de la vía BMP/SMAD a través de la hemojuvelina y de los complejos HFE/TFR2, así como las respuestas de fase aguda mediadas por IL‑6–STAT3. La actividad desregulada de la hepcidina se asocia con una distribución alterada del hierro y con desequilibrios en la eritropoyesis en trastornos como la hemocromatosis hereditaria, la anemia de la inflamación y las anemias con sobrecarga de hierro, lo que convierte a HAMP en un nodo clave para estudiar el metabolismo del hierro y la interacción con la inmunidad innata.

hepcidin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de HAMP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

hepcidin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus HAMP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional HAMP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de hepcidin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo HAMP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de hepcidin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía hepcidin en células tumorales con expresión de HAMP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.