HAS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401951-ACT

Das humane HAS1-Gen kodiert die Hyaluronan-Synthase 1, ein Plasmamembran-Enzym, das Hyaluronan (HA) polymerisiert, ein wichtiges Glykosaminoglykan der extrazellulären Matrix. Durch die Kontrolle von Menge und Molekulargewicht von HA beeinflusst HAS1 die Organisation der perizellulären Matrix, Zelladhäsion und -motilität sowie rezeptorvermittelte Signalübertragung über CD44 und RHAMM. Die HAS1-abhängige HA-Umgestaltung überschneidet sich mit inflammatorischer Signalgebung, Wundreaktionen und stromal-epithelialen Interaktionen, die die Gewebehomöostase prägen. Eine dysregulierte HA-Synthese und veränderte HAS1-Expressionsmuster wurden mit fibrotischen Mikroumgebungen und tumorassoziiertem Matrix-Remodeling in Verbindung gebracht und stützen mechanistische Studien in der Krebsbiologie und Entzündungsforschung.

HAS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HAS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HAS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HAS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HAS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HAS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HAS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HAS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HAS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HAS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.