Plasmide CRISPR d'Activation (m) HAP1: sc-420795-ACT

Le gène murin Hap1 code la protéine associée à la huntingtine 1 (HAP1), une protéine échafaudage cytoplasmique enrichie dans les neurones, impliquée dans le trafic intracellulaire, le transport vésiculaire et l’organisation du cytosquelette. HAP1 interagit avec des complexes moteurs et adaptateurs qui soutiennent la dynamique endosomale et la localisation des récepteurs/transporteurs, ce qui l’associe au maintien synaptique et à l’homéostasie neuronale. Par ces fonctions, HAP1 est étudiée dans des voies pertinentes pour la neurodégénérescence et le neurodéveloppement, notamment des processus liés au transport des protéines et à l’organisation cellulaire en réponse au stress. Des altérations du trafic et de la protéostase associés à HAP1 ont été examinées dans le cadre de la biologie de la maladie de Huntington et, plus largement, des mécanismes de vulnérabilité neuronale.

HAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hap1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

HAP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hap1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hap1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de HAP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hap1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de HAP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie HAP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Hap1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.