Plasmide CRISPR d'Activation (h) hamartin: sc-402444-ACT

Le gène humain **TSC1** code l’hamartine, une protéine d’échafaudage qui forme un complexe fonctionnel avec **TSC2** (tubérine) et agit comme régulateur activateur de la GTPase de **RHEB**, afin de freiner la signalisation de **mTORC1**. Par cet axe, l’hamartine intègre les signaux des facteurs de croissance et de la détection de l’état énergétique pour contrôler la synthèse protéique, l’autophagie, la croissance cellulaire et l’homéostasie métabolique. La perturbation du contrôle de mTORC1 médié par TSC1 dérègle les programmes de taille et de prolifération cellulaires et modifie les réponses au stress. Les variations génétiques de TSC1 sont associées à la biologie liée au complexe de sclérose tubéreuse et sont largement étudiées dans des modèles de dérégulation de la voie mTOR.

hamartin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TSC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

hamartin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TSC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TSC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de hamartin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TSC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de hamartin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie hamartin dans les cellules tumorales présentant une expression de TSC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.