Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRP 75: sc-400471-ACT

HSPA9 code GRP75 (mortalin), une chaperonne de la famille HSP70 associée aux mitochondries, qui soutient l’import, le repliement et la protéostasie des protéines au sein de la matrice mitochondriale. GRP75 contribue à la bioénergétique mitochondriale, à l’assemblage des clusters fer–soufre et aux voies de signalisation adaptatives au stress ; elle participe également à la communication mitochondrie–réticulum endoplasmique (RE), influençant la gestion du calcium et l’homéostasie rédox. Par ces fonctions, HSPA9 est associée à des voies contrôlant la surveillance de la qualité mitochondriale, la sensibilité à l’apoptose et les réponses cellulaires au stress oxydatif et au stress protéotoxique. Une activité et une expression dérégulées de GRP75 ont été liées à des altérations de la fonction mitochondriale et à des phénotypes pertinents pour la neurodégénérescence, les dysfonctions hématopoïétiques et la biologie des cancers dans des systèmes expérimentaux.

GRP 75 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HSPA9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRP 75 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HSPA9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HSPA9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRP 75. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HSPA9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRP 75 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRP 75 dans les cellules tumorales présentant une expression de HSPA9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.