Plasmide CRISPR d'Activation (h) GRK 6: sc-402061-ACT

La GRK6 humaine (kinase 6 des récepteurs couplés aux protéines G) est une kinase sérine/thréonine qui phosphoryle les GPCR activés afin de favoriser le recrutement de la β-arrestine, la désensibilisation des récepteurs et leur trafic endocytaire. En modulant la dynamique de signalisation des GPCR, GRK6 influence des cascades en aval de seconds messagers et de kinases, notamment cAMP/PKA et MAPK/ERK, affectant la migration cellulaire, la signalisation inflammatoire et les réponses neuronales. GRK6 a été étudiée dans le contexte de la régulation des récepteurs de chimiokines et du trafic des cellules immunitaires, avec des liens pertinents pour la maladie rapportés dans des processus de neuro-inflammation, la dérégulation de la signalisation cardiovasculaire et le remodelage des voies GPCR associé au cancer. Son niveau d’expression endogène et son activité dépendante du contexte font de GRK6 un nœud utile pour étudier le biais des récepteurs, l’amplitude du signal et les rétroactions adaptatives au sein des réseaux GPCR.

GRK 6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRK6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GRK 6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRK6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRK6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GRK 6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRK6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GRK 6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GRK 6 dans les cellules tumorales présentant une expression de GRK6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.