Plasmide CRISPR d'Activation (h) GnT-I: sc-409648-ACT

MGAT1 code la N-acétylglucosaminyltransférase I (GnT‑I), une enzyme du Golgi médian qui catalyse la première étape engagée de la conversion des N‑glycanes riches en mannose en N‑glycanes complexes et hybrides. En initiant la ramification de la glycosylation N‑liée, GnT‑I influence le repliement des protéines, leur stabilité, le trafic des récepteurs, ainsi que les interactions cellule‑cellule et cellule‑matrice au sein des protéines sécrétées et membranaires. Le remodelage des glycanes dépendant de MGAT1 s’intègre aux voies de maturation du Golgi et module les réponses de signalisation issues de glycoprotéines impliquées dans l’adhésion et la réactivité aux facteurs de croissance. Une activité de MGAT1 dérégulée et des structures de N‑glycanes altérées sont fréquemment étudiées dans le contexte de la biologie du cancer, de la régulation immunitaire et des troubles congénitaux de la glycosylation, comme contributeurs mécanistiques à des phénotypes cellulaires aberrants.

GnT-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MGAT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GnT-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MGAT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MGAT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GnT-I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MGAT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GnT-I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GnT-I dans les cellules tumorales présentant une expression de MGAT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.