Plasmide CRISPR d'Activation (h) glypican-3: sc-400256-ACT

GPC3 code la glypican-3, un protéoglycane à héparane sulfate ancré au glycosylphosphatidylinositol (GPI), localisé à l’interface entre la surface cellulaire et la matrice extracellulaire. La glypican-3 module la disponibilité des morphogènes et des facteurs de croissance ainsi que leur portée de signalisation, influençant des voies telles que Wnt/β-caténine, Hedgehog, FGF et BMP, afin de réguler la prolifération cellulaire, l’adhésion et l’organisation des patrons de développement. Une expression altérée de GPC3 est associée à une dérégulation de la croissance tissulaire et à des programmes de signalisation oncogéniques, et fait l’objet de nombreuses études en tant que régulateur dépendant du contexte dans la biologie du foie et les états cellulaires associés aux tumeurs. Ces propriétés font de GPC3 un point d’entrée utile pour disséquer la signalisation dépendante de l’héparane sulfate, les interactions récepteur–ligand et la régulation microenvironnementale des gradients de facteurs de croissance.

glypican-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GPC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

glypican-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GPC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GPC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de glypican-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GPC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de glypican-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie glypican-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de GPC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.