Plásmido CRISPR de Activación (h) glypican-3: sc-400256-ACT

GPC3 codifica la glicpican-3, un proteoglicano de heparán sulfato anclado a glicofosfatidilinositol (GPI), localizado en la superficie celular y en la interfaz con la matriz extracelular. La glicpican-3 modula la disponibilidad y el alcance de señalización de morfógenos y factores de crecimiento, influyendo en vías como Wnt/β-catenina, Hedgehog, FGF y BMP para regular la proliferación celular, la adhesión y los patrones del desarrollo. La expresión alterada de GPC3 se asocia con un crecimiento tisular desregulado y programas de señalización oncogénica, y se estudia ampliamente como un regulador dependiente del contexto en la biología hepática y en estados celulares asociados a tumores. Estas propiedades hacen de GPC3 un punto de entrada útil para diseccionar la señalización dependiente de heparán sulfato, las interacciones receptor–ligando y la regulación microambiental de los gradientes de factores de crecimiento.

glypican-3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de GPC3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

glypican-3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus GPC3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional GPC3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de glypican-3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo GPC3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de glypican-3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía glypican-3 en células tumorales con expresión de GPC3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.