Plasmide CRISPR d'Activation (h) Get4: sc-407595-ACT

Le gène humain GET4 code Get4, un composant conservé de la voie TRC/GET qui soutient la protéostasie en coordonnant la prise en charge post-traductionnelle et l’insertion membranaire des protéines à ancrage C-terminal (« tail-anchored »). Get4 interagit avec des modules de co-chaperons et des partenaires tels que BAG6/SGTA et TRC40/ASNA1 afin de trier des clients hydrophobes, en aidant à les orienter soit vers le ciblage du réticulum endoplasmique, soit vers une dégradation par les mécanismes de contrôle qualité. Par son rôle dans la biogenèse des protéines « tail-anchored », GET4 influence l’homéostasie du RE, le trafic membranaire et les réponses au stress cellulaire, fréquemment perturbés dans les cancers et dans les déséquilibres de protéostasie associés aux maladies neurodégénératives. Une activité altérée de GET4 peut donc être pertinente pour l’étude de voies liées à l’agrégation protéique, à la signalisation du stress du RE et au renouvellement médié par l’ubiquitine.

Get4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GET4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Get4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GET4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GET4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Get4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GET4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Get4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Get4 dans les cellules tumorales présentant une expression de GET4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.