Gemin3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403271-ACT

O DDX20 humano codifica a Gemin3, uma helicase de RNA da família DEAD-box dependente de ATP que atua como componente central do complexo SMN–Gemin e da via de montagem de snRNPs spliceossomais. A Gemin3 participa do metabolismo de RNA ao remodelar complexos ribonucleoproteicos, dando suporte ao splicing de pré-mRNA, à maturação de snRNA e a uma regulação gênica pós-transcricional mais ampla. Por meio de interações com a SMN e outras proteínas Gemin, ajuda a manter a fidelidade do processamento de RNA e a proteostase no núcleo e no citoplasma. A desregulação de programas de processamento de RNA ligados a DDX20/Gemin3 tem sido associada a redes transcricionais alteradas e a fenótipos relevantes para doenças em modelos de biologia neuromuscular e de câncer.

Gemin3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DDX20 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gemin3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DDX20 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DDX20, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gemin3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DDX20 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gemin3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gemin3 em células tumorais com expressão de DDX20 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.