Plasmide CRISPR d'Activation (h) GCH-I: sc-402386-ACT

Le gène humain GCH1 code la GTP cyclohydrolase I (GCH-I), l’enzyme limitante de la biosynthèse de novo de la tétrahydrobioptérine (BH4) à partir du GTP. La BH4 est un cofacteur essentiel, redox-actif, des hydroxylases des acides aminés aromatiques et de toutes les isoformes de la NO synthase (NOS), reliant l’activité de la GCH-I au métabolisme des catécholamines et de la sérotonine, ainsi qu’à la production d’oxyde nitrique et à la signalisation endothéliale. En régulant la disponibilité en BH4, GCH1 influence l’équilibre du stress oxydant, l’homéostasie des neurotransmetteurs et le contrôle du tonus vasculaire. Des altérations de l’axe GCH1/BH4 ont été associées à des troubles impliquant le métabolisme des monoamines et des voies dépendantes du NO, notamment des états liés à l’hyperphénylalaninémie, des phénotypes douloureux, ainsi que des contextes de recherche cardiovasculaires ou neuropsychiatriques.

GCH-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GCH1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GCH-I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GCH1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GCH1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GCH-I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GCH1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GCH-I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GCH-I dans les cellules tumorales présentant une expression de GCH1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.