Plasmide CRISPR d'Activation (m) GAP1^m: sc-431130-ACT

Rasa2 code pour la protéine murine GAP1m, une protéine d’activation de l’activité GTPase de Ras (RasGAP) qui régule négativement la signalisation Ras en accélérant l’hydrolyse du GTP afin de limiter l’activité de Ras. En réduisant la sortie des voies en aval RAF–MEK–ERK et PI3K–AKT, GAP1m influence la prolifération, la différenciation et la dynamique du cytosquelette dans divers types cellulaires. Une expression ou une fonction altérée de Rasa2 peut déplacer les seuils de signalisation qui contrôlent la réponse aux facteurs de croissance et l’adaptation au stress, ce qui la rend pertinente pour l’étude de la dérégulation oncogénique de la voie Ras et des phénotypes développementaux. Dans des contextes immunitaires et stromaux, la modulation de l’atténuation de Ras par Rasa2 est également associée à des changements d’état d’activation et d’homéostasie tissulaire.

GAP1m Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Rasa2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAP1m Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Rasa2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Rasa2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAP1m. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Rasa2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAP1m au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAP1m dans les cellules tumorales présentant une expression de Rasa2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.