Plasmide CRISPR d'Activation (h) FUCA1: sc-405275-ACT

FUCA1 code l’α-L-fucosidase lysosomale 1, une glycosidase qui élimine les résidus de fucose terminaux des glycannes liés en N, des glycolipides et des glycoprotéines au cours du catabolisme des glycannes. En soutenant le renouvellement et le recyclage, dépendants des lysosomes, des substrats fucosylés, FUCA1 contribue à l’homéostasie de la glycosylation cellulaire ainsi qu’à des processus plus larges liés au trafic endo-lysosomal et à la protéostase. Une activité fucosidase altérée peut perturber le remodelage des glycannes et les sorties de signalisation associées aux interactions cellule–cellule, à l’inflammation et aux réponses au stress. FUCA1 est également impliquée dans les pathologies héréditaires de surcharge lysosomale et est fréquemment étudiée dans des modèles reliant une glycosylation aberrante à des phénotypes cancéreux et neurodégénératifs.

FUCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FUCA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

FUCA1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FUCA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FUCA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de FUCA1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FUCA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de FUCA1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie FUCA1 dans les cellules tumorales présentant une expression de FUCA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.